Nat Biomed Eng | 璩良课题组开发碱基修饰环状RNA技术

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20世纪90年代，研究人员已建立成熟的体外转录体系，可合成携带5'帽-Cap和3' poly(A)尾的线性mRNA，实现靶标蛋白的体内表达。然而，未经碱基修饰的体外转录mRNA免疫原性强，导入体内后诱发强烈天然免疫刺激，严重制约了其医学应用，导致mRNA早期转化研究长期停滞。2005年，美国宾夕法尼亚大学WEIssman/Karikó团队证实，体外转录制备mRNA时用化学修饰的核糖核苷碱基（ψ）替代原始碱基（U）,可显著降低其免疫原性，抑制天然免疫刺激反应（Immunity, 2005）。这一突破解决了mRNA的安全性瓶颈，为线性mRNA疫苗及其生物医药技术产业化奠定了核心基础，推动该领域进入快速发展期。2019年，COVID-19疫情暴发后，线性mRNA疫苗以研发周期短、制备效率高、免疫保护效力优异等优势快速转化、获批上市并被广泛接种。碱基修饰这一发现成为mRNA疫苗重大突破，Weissman和Karikó两位科学家也因此项成果荣获2023年诺贝尔生理学或医学奖。但线性mRNA稳定性低、半衰期短，制约了其长效应用与广谱产业化。2022年，北京大学魏文胜教授团队在国际上率先报道circRNA疫苗技术平台（详见BioArt报道：）, circRNA的共价闭合环形结构显著提升了其体内稳定性、大幅延长半衰期，有效弥补了线性mRNA的稳定性缺陷。但是，circRNA的免疫原性问题尚未被解决。与线性mRNA类似，体外转录制备的circRNA在哺乳动物细胞中会引发强烈的天然免疫刺激反应，而circRNA目前尚无法跟mRNA一样通过完全碱基修饰降低其免疫原性，导致circRNA进入机体会引发强烈的天然免疫刺激反应、翻译效率降低、安全性等问题，使得其目前主要局限于疫苗开发应用。其根本原因是体外制备circRNA如果用修饰碱基（比如ψ）替代原始碱基（U），则会破坏circRNA中关键的环化元件和翻译起始元件IRES的二级结构，导致RNA环化失败、蛋白翻译失败。
% J# c- p$ V/ B2026年6月29日，复旦大学璩良课题组在Nature Biomedical Engineering期刊在线发表题为Engineered circular RNA compatible with complete nucleoside modification and rolling circle translation through a Cap-independent translation enhancer研究论文，报道了碱基修饰环状RNA（circRNA）技术平台，消除了circRNA在体内的天然免疫刺激反应；碱基修饰circRNA兼具高稳定性和低免疫原性优势，显著提升了circRNA癌症疫苗的抗肿瘤效果，并拓展了circRNA技术在疫苗外的应用新场景。
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( B& B; P$ Q9 z; C2 U8 {) SCircRNA主要通过IRES元件介导翻译起始，但IRES元件序列长、结构复杂、修饰碱基兼容度低。复旦大学璩良课题组将研究目光转向其它类型的翻译起始元件——Cap非依赖的翻译增强子（CITE）元件。利用荧光报告系统，筛选鉴定出可以在细胞内启动蛋白质翻译的候选CITE元件，其中，39-nt的BBV元件可以介导碱基修饰RNA的翻译。进一步，研究团队发现100%修饰碱基的引入不影响RzL核酶介导的精准连接，实现完全碱基修饰RNA的精准环化，在此基础上开发了碱基修饰circRNA技术平台。研究人员还发现，尽管BBV元件在环状RNA中启动翻译的能力有限，但是可以利用滚环翻译实现碱基修饰circRNA的高效蛋白翻译。
研究团队进一步证明了碱基修饰有效消除了circRNA在体内的天然免疫刺激反应。在A549细胞系、人原代T细胞以及小鼠体内，碱基修饰circRNA降低了先天免疫反应相关基因的表达。转录组分析显示，碱基修饰circRNA导入细胞后表现出与对照组相似的免疫相关基因表达谱；相比未修饰circRNA，碱基修饰circRNA抑制了天然免疫信号通路的激活。CircRNA碱基修饰的实现让其同时具备了高稳定性和低免疫原性。
# \, q  w. |% U' H: @( i接下来，研究团队探索了碱基修饰circRNA的技术优势。此前领域内长期的共识认为RNA疫苗引发的天然免疫刺激反应可作为疫苗佐剂发挥活性，因而在一定程度上是可接受甚至是被期望的。但是研究团队发现，基于碱基修饰circRNA开发的癌症疫苗，效果显著优于未修饰circRNA疫苗以及碱基修饰mRNA疫苗。这一结果为未来开发癌症疫苗或感染性病毒疫苗提供了全新的技术路线。
& [, w4 l: j  _: _* z进一步，研究团队探索了碱基修饰circRNA技术的疫苗外应用新场景。胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是调节血糖稳态的关键分子，GLP-1类似物被用于糖尿病和肥胖症等疾病的临床治疗，然而，其生物利用度和体内半衰期是临床应用的主要限制。研究团队利用碱基修饰circRNA表达GLP-1，有效控制饮食诱导肥胖小鼠的血糖水平，改善脂肪肝损伤，为基于碱基修饰circRNA技术的蛋白替代疗法奠定基础。此外，传统疫苗诱导免疫激活，但在非促炎性条件下呈递抗原可以建立抗原特异性免疫耐受，这是治疗自身免疫性疾病的策略之一。在自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中，编码髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）的碱基修饰circRNA降低EAE小鼠脑和脊髓中免疫细胞的浸润，减轻脱髓鞘的症状，缓解了疾病进展，验证了基于碱基修饰circRNA的自身免疫耐受疗法概念。
总结来说，该研究针对circRNA不兼容碱基修饰、在体内引发强烈天然免疫刺激的技术瓶颈，通过筛选可兼容碱基修饰的CITE翻译起始元件和环化核酶元件，开发了可高效翻译蛋白质的碱基修饰circRNA技术平台；circRNA的碱基修饰显著消除了其在体内的天然免疫刺激反应，使得circRNA同时兼具高稳定性和低免疫原性突出优势，显著提升了circRNA癌症疫苗的抗肿瘤效果，并拓展了circRNA技术在疫苗外的应用新场景。
复旦大学基础医学院/附属中山医院璩良课题组王芯玥（23级博士生）、潘倩（博士后）、尹洁（研究助理）、寇灏萌（24级博士生）、廖欣缘（24级博士生）为论文共同第一作者，璩良研究员和潘倩博士为论文共同通讯作者。
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