Elife|哈尔滨医科大学孙斌教授课题组揭示豆蔻酰化修饰调控病毒无序蛋白VP4 ...

秋风一刀

小RNA病毒编码的VP4蛋白是一种小型的天然无序蛋白，在病毒入侵时通过与宿主细胞膜或内体膜相互作用，形成具有尺寸选择性的跨膜孔道，实现病毒基因组的传递。其中，VP4的一个关键特征是其N端会发生豆蔻酰化修饰，该修饰在多种小RNA病毒的感染时都不可或缺，而在另一些病毒中则并非必要，这提示豆蔻酰化修饰的作用复杂且高度依赖特定条件。目前，对于豆蔻酰化修饰驱动无序VP4 蛋白突破膜屏障的生物物理机制仍有待阐明。
近日，哈尔滨医科大学孙斌教授联合王燕教授课题组，以B组柯萨奇病毒（Coxsackievirus B，CVB）VP4为模型，通过整合多尺度分子动力学模拟与分子生物学实验，证明豆蔻酰化修饰并非仅单纯发挥膜锚定作用，而是作为多功能调节因子通过多层级的协同作用调控VP4的破膜活性。相关结果以题为“Myristoylation licenses disordered viral VP4 protEIn to anchor to and perforate the membrane through phase separation”发表于国际高水平期刊《eLife》。


$ L3 K$ @( S6 _  `" k4 u首先，作者通过长时间粗粒度模拟发现，VP4-MYR（发生豆蔻酰化修饰的VP4）通过将N端的豆蔻酰基团插入膜内实现稳定结合，而VP4-noMYR(未发生的VP4)在接触膜后即被弹走，始终无法锚定。此外，作者还发现VP4的高度结构柔性是其依赖豆蔻酰化修饰与膜稳定结合的关键前提，当柔性降低后VP4结合膜的速度以及豆蔻酰基团插入膜的深度均出现明显减弱。
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接下来，作者分别将带有EGFP标签的wild-type (WT) VP4和G2A mutant VP4分别转染至HEK293T细胞中。结果显示，豆蔻酰化修饰的WT-VP4蛋白定位在细胞膜上，而未经修饰的G2A-VP4则弥散的分布在胞浆中，证实了豆蔻酰化修饰是VP4与膜结合的关键。值得注意的是，作者发现VP4-MYR在膜上呈点状聚集。结合VP4是无序蛋白，作者推测VP4可能在膜上发生了液-液相分离（Liquid-Liquid Phase Separation,LLPS）。后续的延时成像和Frap实验证实了VP4具有很强的流动性，确定VP4在膜上聚集发生了LLPS。随后，作者构建并模拟了由多个VP4与膜共同构成的复杂体系。观察VP4的聚集过程，作者发现部分VP4通过豆蔻酰基团锚定在膜表面后利用自身疏水的C端捕捉溶液中游离于膜外的豆蔻酰基团，最终在膜表面形成以豆蔻酰基团为疏水核心的动态液滴。同时，增加VP4的浓度有利于液滴的聚集和稳定。
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后续，通过分析液滴下方膜的形变程度，作者发现VP4液滴具有强大的膜重塑能力，会诱导下方的膜出现显著形变。进一步将该现象与VP4的膜穿孔功能相联系，作者证实液滴通过重塑下方膜降低VP4向膜内插入的能垒，促进VP4转移入膜。
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0 B0 e& a. H, @0 O& g$ B最后，作者探究了VP4在跨膜孔道的潜在结构，以及豆蔻酰化修饰对VP4孔道的影响。作者发现VP4 N端在膜环境下会发生从无序构象向螺旋结构的构象转变，而豆蔻酰化修饰不仅促进VP4折叠形成螺旋，还能增强其向膜内插入的能力。进一步，作者基于文献报道构建了VP4的六聚体跨膜孔道模型，经过长时间模拟后发现豆蔻酰基团通过与膜内的脂质分子形成疏水相互作用，不仅维持了孔道的整体稳定还增强了物质转运能力。
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  {2 v3 p$ D) y( M综上所述，本研究通过多尺度分子模拟与实验相结合，系统揭示了豆蔻酰化修饰如何调控VP4蛋白膜锚定、液滴形成及膜重塑的功能，并阐明了该修饰在降低VP4穿透膜能垒中的关键作用，为理解缺少囊膜的小RNA病毒入侵过程中豆蔻酰化依赖性的分子机制提供了坚实的生物物理框架。
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哈尔滨医科大学药学院博士后黄思超为第一作者，邓凤真博士与刘特博士为共同第一作者，孙斌教授、王燕教授与张满杰教授担任通讯作者。本研究受到国家自然科学基金（32501103）、中国博后基金（2023M730827, 2025MD784111）和黑龙江省博后基金(LBH-Z24211)等项目资助。
) }' g2 ^; J% o. A, r4 |论文链接：https://elifeSCIences.org/reviewed-preprints/111302v1