Advanced Science | 柏连阳院士团队潘浪课题组揭示GA-GID1/DELLA-DOF2-P450 ...

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稗草（Echinochloa crus-galli）是世界性恶性杂草，被列为我国农田15种危害严重的杂草之首。长期以来，稗草的防控高度依赖化学除草剂，尤其是乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制类除草剂，如五氟磺草胺。然而，除草剂的连续使用已导致稗草抗药性的迅速进化，严重威胁水稻生产。我国稗草已对五氟磺草胺产生严重抗药性，且呈不断扩大趋势。除靶标位点ALS突变外，对五氟磺草胺的非靶标抗性（NTSR）也普遍存在。其中，细胞色素P450单加氧酶（P450s）参与的代谢抗性可对不同化学类别和作用方式的多种除草剂产生交互抗性及多抗性，已成为农田杂草防控中最棘手的难题。由于P450基因家族庞大，且缺乏注释完善的杂草基因组，杂草中参与代谢抗性的特异性P450基因的发现一直进展缓慢，直至2014年才在水田稗（Echinochloa   phyllopogon）中里程碑式地鉴定到CYP81A21基因。此后，在少数禾本科杂草中已鉴定出多个主要归属于CYP81、CYP704和CYP709家族的P450基因。在迄今报道的几乎所有案例中，抗性均源于已鉴定P450基因的高表达。然而，这些基因为何在抗性杂草中特异性高表达，其上游受何种分子信号与转录通路调控，始终是领域内的研究空白。
) ]$ {* U/ b  P& e近日，柏连阳院士团队潘浪教授课题组在国际著名综合性学术期刊Advanced SCIence上在线发表了题为“Herbicide metabolic resistance inPoaceaeplants via the GA-GID1/DELLA-DOF2-P450s module”的研究论文。该研究鉴定出DOF家族转录因子DOF2是稗草和水稻中除草剂代谢抗性的核心调控因子，并阐明了一个由赤霉素激素信号（GA–DELLA/GID1）、核心转录因子（DOF2）和解毒代谢酶（P450）构成的完整调控功能模块。该模块在稗草和水稻两种禾本科植物中调控除草剂解毒与抗性，为杂草抗性治理和耐除草剂作物种质改良提供了重要启示。


DOF家族是植物特有的锌指转录因子家族，广泛参与生长发育与胁迫应答，但其是否参与除草剂抗性调控此前尚无报道。研究团队对抗性与敏感型稗草转录组数据进行联合筛选，发现EcDOF2在抗性稗草中呈组成型高表达，且受除草剂处理进一步诱导，从而将其锁定为抗性相关的核心转录因子。基因测序证实，抗性和敏感稗草的EcDOF2编码区与启动子均无序列突变，抗性差异完全来源于基因转录水平的上调。亚细胞定位与转录激活实验表明，EcDOF2定位于细胞核，其蛋白C端具备转录激活活性。在稗草中过表达EcDOF2及其在水稻中的直系同源基因，可赋予植株对除草剂的抗性并增强耐受性，而敲除水稻中的直系同源基因OsDOF2则会增加对除草剂的敏感性。这些结果证明，DOF2是禾本科植物调控除草剂代谢抗性的正向核心开关。
) F. p- {& k+ ]6 y9 S8 V为鉴定DOF2的直接靶基因，该研究整合了DAP-seq与RNA-seq的差异基因联合分析结果，筛选出EcDOF2直接结合并激活的下游关键 P450 解毒基因，包括已知的主要除草剂解毒基因 CYP81A6（水稻）、CYP81A21（稗草），以及一个新基因 CYP704A371（稗草）。进一步通过酵母单杂交、双荧光素酶、EMSA等体内外多重互作实验，验证了稗草EcDOF2可特异性结合两个P450 基因启动子的DOF顺式元件并启动转录；水稻OsDOF2则可激活经典除草剂解毒基因OsCYP81A6。功能验证结果表明，过表达EcCYP81A21、EcCYP704A371和OsCYP81A6基因均可赋予转基因植株对除草剂的耐受性，从而解析了DOF2 直接调控P450解毒的分子通路。
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4 S& Q5 l. Y* l; s* [+ NDOF2抗药性功能鉴定及其调控机制解析
6 O) b% d% b3 z0 X' j3 ]+ ~研究还揭示了赤霉素（GA）信号与除草剂抗性之间的内在联系机制。除草剂处理可显著诱导稗草GA合成关键基因GA20ox和GA3ox上调，导致内源活性赤霉素含量大幅积累。外源施加GA可快速诱导EcDOF2及其下游解毒基因表达；而使用赤霉素合成抑制剂多效唑（PAC）处理抗性稗草，则可直接抑制EcDOF2与P450基因的表达，从而逆转稗草的抗药性。GA信号通路依靠受体GID1与抑制蛋白DELLA完成信号转导，研究表明该通路中GID1基因的缺失突变体水稻对除草剂的耐受性显著下降，GA无法再诱导抗性产生。此外，Y2H、LCI、Co-IP及GST pull-down等实验证实，DELLA蛋白可与DOF2发生直接蛋白互作，阻碍 DOF2结合靶标基因启动子，从而负向抑制代谢基因转录。这表明DELLA蛋白SLR1与DOF2相互作用，抑制其转录活性；而GA信号则解除这一抑制作用，从而激活P450。且过表达DELLA会增强转基因植株对除草剂的敏感性，而DELLA功能缺失则提高耐受性。
上述结果表明，GA-GID1/DELLA-DOF2-P450s调控模块在稗草与水稻等禾本科植物中具有保守性。这些发现完善了杂草非靶标抗性的分子调控理论体系，也为作物抗逆遗传改良和新型杂草防控策略的开发提供了重要理论支撑。
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! @; G5 [/ Q/ X0 o1 V5 G& cGA-GID1/DELLA-DOF2-P450s模块调控稗草抗药性的模式图
( W$ d& r: V: k5 e/ y0 G" z柏连阳院士和湖南农业大学潘浪教授为该论文的共同通讯作者，团队王军志副研究员和博士研究生齐家乐为该论文的共同第一作者。该研究得到了国家重点研发计划和国家产业技术体系等项目的资助。
论文链接：
https://doi.org/10.1002/advs.76742