伦敦大学学院：水凝胶微柱登上《Nature Methods》！

习惯就好。

十余年前，研究人员提出并实现了基于微柱阵列的髓鞘化二元指示系统（BIMA），用于筛选可促进髓鞘再生的小分子化合物。BIMA 的设计初衷是验证一种概念：可将细胞膜包裹作为主要终点指标，对少突胶质细胞（OL）的分化进行高通量筛选。受限于当时可用材料与轴突结构的高长径比，初代微柱在尺寸、形状与刚性上均无法模拟轴突，也无法切片用于透射电子显微镜观察。因此，尽管并非最初设计目标，少突胶质细胞的细胞生物学过程仍无法得到有意义的研究。
: `- q6 p4 r3 W9 p" R. ?近日，伦敦大学学院Emad Moeendarbary等人引入了可调控的水凝胶基微柱阵列，以模拟轴突相关的生物力学信号。制备出与轴突在尺寸、形状与刚性上高度相似的微柱，使得研究人员能够探究少突胶质细胞的细胞生物学特性，以细胞自主方式研究其成髓鞘潜能、髓鞘形成范围与包裹动力学。由于该平台可模拟轴突所需的力学与几何特性，有望为少突胶质细胞髓鞘化相关的基础细胞生物学过程提供重要见解。

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为少突胶质细胞分化与髓鞘化构建最低限度允许环境，是一种还原论研究策略，有助于明确在无抑制信号存在时，少突胶质细胞对与轴突尺寸、形状相似结构进行髓鞘化的内在能力。基于 BIMA 的高通量筛选已发现多个靶点与研究方向，相关成果已推动多发性硬化症患者髓鞘再生疗法成功进入临床试验。然而，以这种细胞自主方式研究少突胶质细胞，对于髓鞘形成背后动态细胞生物学过程的认知仍十分有限。
研究人员现已在体外实现了轴突可变几何特性的建模。研究人员采用聚丙烯酰胺水凝胶，以可调控方式构建微柱阵列。通过光刻技术将硅片加工为微图案模具，可调控亚微米级分辨率，从而实现柱间距、柱直径等目标参数（图 1a）。此外，改变水凝胶组成（单体与交联剂）可实现宽范围刚度调控，从 0.52 kPa（超软）至 54.85 kPa（刚性）。因此，该微柱可模拟大脑（0.5 kPa）与轴突（5 kPa）的刚度。以往研究仅采用固定图案与有限材料制备微柱或纳米纤维。这些可调控特性代表了重大技术进步，微柱可按需定制直径、密度、刚性等参数。
4 G5 g- I3 X5 A: N# `为验证少突胶质细胞分化与髓鞘化，研究人员将纯化的大鼠少突胶质前体细胞（OPC）、人胎儿神经前体细胞来源的 OPC、多能干细胞来源的 OPC 在微柱阵列上培养长达两周（图 1b）。与在平面聚丙烯酰胺水凝胶上培养相比，在该阵列上培养的少突胶质细胞随细胞密度升高，呈现出与少突胶质细胞成熟相关的激活转录组（图 1c）。这一结果符合拓扑信号可促进 OPC 增殖与少突胶质细胞分化的观点，证实该平台适用于体外研究少突胶质细胞分化与髓鞘化。平台的显微镜兼容性是另一关键特性，可准确评估少突胶质细胞在微柱阵列上的包裹与髓鞘化。为适配该平台的共聚焦成像，研究人员在水凝胶基微柱中加入异硫氰酸荧光素（FITC），使其在共聚焦显微镜下可见（图 1b）。基于 z 轴层扫重建图像，少突胶质细胞包裹程度可从 0 分（无包裹）至 3 分（完全包裹）进行评分，从而精准评估少突胶质细胞的髓鞘化包裹能力。重要的是，与聚苯乙烯、熔融石英等其他材料相比，水凝胶基微柱更适合透射电子显微镜（TEM）包埋与切片。
1 B  m6 T! ~4 Z) M因此，在水平透射电镜切片上可清晰观察到包裹微柱的致密多层膜结构（图 1b）。半数微柱被平均 3.58 层髓鞘包裹，表明在无生化信号的情况下，伪轴突底物上可发生广泛的从头髓鞘形成。
借助可调控水凝胶基微柱阵列，研究人员探究了轴突单一生物力学信号与细胞外基质成分对少突胶质细胞分化与髓鞘化的影响。为模拟不同轴突间距与直径，研究人员在平台上制备不同直径（3、5、10 μm）与柱间距（5、10、15 μm）的微柱，并与大鼠 OPC 共培养（图 1b）。有趣的是，不同直径与柱间距下，评分为 1 分或 2 分的微柱比例一致。相比之下，当柱直径从 3 μm增至 5 μm、或柱间距从 5 μm增至 10 μm时，评分为 3 分的微柱比例升高。这些结果表明，少突胶质细胞的包裹效率可能与轴突直径 / 间距比值相关。直径为 3、5、10 μm的包裹微柱的估算 g 值（轴突直径与髓鞘总直径比值），大于体内轴突的 g 值。这些结果提示，轴突直径与密度受少突胶质细胞髓鞘化的精细调控。
研究人员还制备了不同直径（5 或 10 μm）与刚度（0.5 kPa超软、5 kPa软、50 kPa刚性）的微柱阵列，以模拟不同组织刚度。总体而言，无论柱直径如何，少突胶质细胞更倾向于包裹刚性更高的微柱阵列。该结果支持软组织可维持少突胶质细胞祖细胞状态的观点。有趣的是，仅在直径 10 μm的微柱阵列上，三种刚度条件下的少突胶质细胞髓鞘化才存在统计学差异。这表明刚度与直径协同调控少突胶质细胞的包裹能力。
" t% p0 n- k! q+ G# _为明确生化信号对髓鞘化的影响，研究人员将少突胶质细胞培养在三种不同底物包被的微柱阵列上：多聚赖氨酸（PDL）、层粘连蛋白、纤连蛋白（图 1c）。层粘连蛋白包被组的完全髓鞘化微柱比例升高，这与此前证实层粘连蛋白可有效促进少突胶质细胞分化的结论一致。同时，与多聚赖氨酸包被组相比，纤连蛋白包被组中每个少突胶质细胞包裹的微柱数量更多。由于不同包被方式未改变细胞密度，这些结果表明髓鞘化能力的调控独立于少突胶质细胞分化。
5 d* M# H; B9 c% L5 b% _1 o最后，研究人员验证了该平台作为髓鞘再生药物高通量筛选系统的适用性。此前已发现的促髓鞘化药物（氯马斯汀、苯托品、GSK239512、辛伐他汀）可增强少突胶质细胞髓鞘化能力，且不改变细胞密度，尽管这些药物的分子靶点不同（图 1c）。相反，维司他汀通过抑制少突胶质细胞突起延伸与细胞骨架重排，降低微柱上的少突胶质细胞包裹评分。值得注意的是，与刚性微柱（20 kPa）相比，所有药物的促髓鞘化效应在软微柱（5 kPa）上均显著减弱，提示刚度是体外平台避免假阳性结果的关键考量因素。这些发现表明，微柱阵列可改造为促髓鞘化药物筛选平台。


( a& b% @5 `$ Q$ ]$ O/ q: G3 X图|水凝胶基微柱阵列
7 k! i) p$ B6 l  N& |本研究介绍了一种构建可调控水凝胶基微柱阵列的新方法，证实轴突直径、密度与刚度如何影响少突胶质细胞分化与髓鞘化。对这些特性的分析为模拟多种轴突力学信号与细胞外基质提供了可行路径。包裹能力评分提供了一种可量化方法，用于衡量少突胶质细胞的髓鞘化动力学与能力。除研究少突胶质细胞的细胞生物学外，这种经济高效的新一代平台在髓鞘再生疗法高通量筛选方面具有巨大潜力。
该微柱可用于发现并克服髓鞘再生的各类限制 —— 例如，在小直径轴突、不规则形状或受损轴突、抑制性微环境存在的情况下筛选分子 ——若结合机器学习与深度学习辅助高内涵筛选的定量分析，其应用效果将尤为显著。
参考文献：
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